過表達靶蛋白的穩轉細胞株構建

        外源基因在細胞中的表達可分為兩大類，一類是瞬時表達，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達到高水平的表達，但通常只持續幾天；一類是穩定表達（構建穩轉株），外源DNA整合到宿主細胞染色體上，使宿主細胞可長期表達目的基因。

        建立穩定細胞株，基本原理是將外源DNA克隆到具有某種抗性的載體上，載體被轉染到宿主細胞并整合到宿主染色體中，用載體中所含的抗性標志進行篩選，得到可穩定表達目的蛋白的細胞株。

      示例：MSLN過表達細胞株的構建

1.       過表達人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒載體構建，其結構圖如圖 1所示：

Fig.1  MSLN慢病毒載體圖譜

2.       將制備的慢病毒載體及慢病毒包裝質粒PspaX2、PMD2 .0G轉染293T細胞，包裝72小時后回收病毒；

3.       檢測病毒滴度，以三種不同的滴度感染CHO-K1宿主細胞，24小時后更換培養基；

4.       以未感染慢病毒的CHO-K1細胞（以下稱為CHO-K1-blank）為陰性對照組，以感染慢病毒的CHO-K1細胞（以下稱為CHO-K1-MSLN）cell pool為實驗組，各組加入不同的藥物濃度加壓篩選，選取適當的藥物濃度后擴大培養4-5代。

5.       以梯度稀釋法在96孔板中培養CHO-K1-MSLN細胞，5天后觀察細胞生長并挑選單克隆細胞進行擴大培養。

6.       取2E5擴大培養的單克隆細胞，FACS buffer洗兩遍后加入陽性檢測抗體(220812A01)^[1]，如下圖所示，流式細胞術檢測MSLN蛋白的表達。

流式檢測MSLN表達 

        費洛斯的慢病毒感染篩選穩定細胞株平臺基于載體中所含的抗性標志進行篩選，常用的真核表達載體的抗性篩選標志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，篩選得到可穩定表達目的蛋白的穩定細胞株，為基礎研究（基因功能研究）、藥物篩選（CAR開發前期scFv篩選）等提供科研助力。

[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.

[2].CN109762844A.2019.05.17